導(dǎo)讀

      目前HDX-MS裝置的工作流程主要基于Peltier冷卻的 高效液相色譜方法，但該系統(tǒng)價(jià)格昂貴成本較高并且在低溫條件下，流動(dòng)相粘度增加導(dǎo)致高背壓降低了LC的分離效率。而毛細(xì)管電泳在HDX領(lǐng)域更具潛力。

     大家好，本周為大家分享一篇發(fā)表在Analytical Chemistry上的文章，Zero-Degree Celsius Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization for Hydrogen Exchange Mass Spectrometry¹，文章的通訊作者為烏普薩拉大學(xué)的Erik T. Jansson博士。

　　氫氘交換質(zhì)譜(HDX-MS)適用于研究蛋白質(zhì)在溶液中的動(dòng)力學(xué)和相互作用，其能夠快速分析非變性蛋白中位于蛋白表面的氨基酸序列，廣泛應(yīng)用于蛋白動(dòng)態(tài)表位、活性位點(diǎn)的表征。HDX-MS平臺(tái)通過(guò)低溫UPLC分離提供自動(dòng)化、在線的樣品處理和分析。目前，HDX-MS裝置的工作流程主要基于Peltier冷卻的 高效液相色譜(UPLC)模塊的LC-MS方法，但該系統(tǒng)價(jià)格昂貴，成本較高，并且在低溫條件下，流動(dòng)相粘度增加導(dǎo)致高背壓(可達(dá)-20,000 psi)，降低了LC的分離效率。而毛細(xì)管電泳(CE)在HDX領(lǐng)域有著更好的應(yīng)用潛力。

       CE是一種成熟的分離多種類型分子的方法，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有獨(dú)特的價(jià)值。CE基于分析物在電場(chǎng)中的不同遷移率進(jìn)行分離，分離速度取決于分析物的尺寸和電荷。20世紀(jì)90年代初，CE-MS開始應(yīng)用于肽段水平的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的分析。自此，CE-MS在多肽和蛋白異質(zhì)體的檢測(cè)中就顯示出比反相LC-MS高10~100倍的靈敏度。近年來(lái)，HDX-MS領(lǐng)域的研究人員也聚焦于探究CE用于HDX-MS工作中的潛在優(yōu)勢(shì)。本文利用熔融硅毛細(xì)管電泳在零攝氏度下完成了氘代肽段和蛋白的淬滅、酶切和分離，該平臺(tái)具有較好的成本效益，易于裝配于任何MS。

　　CE裝置的主要配件包括丙烯酸氣密匣(圖1A)、毛細(xì)管液相分離裝置(圖1C)和P-727聚醚醚酮三通組件(圖1D)。丙烯酸氣密匣用于接收N2，內(nèi)部放有一個(gè)不銹鋼小瓶裝納氘代背景電解液，能夠允許高電壓傳導(dǎo)到分離毛細(xì)管。P-727聚醚醚酮三通組件聯(lián)通高壓電源和N2源，提供分離電壓和N2，在毛細(xì)管出口產(chǎn)生離子。

       圖1.Peltier冷卻CE外殼+進(jìn)樣槽的結(jié)構(gòu)。(A) 丙烯酸氣密匣。(B) Peltier冷卻單元所粘附的鋁殼體的截面。(C) 毛細(xì)管液相分離裝置。(D) 同軸三通閥nano電噴霧針。

　　完成該毛細(xì)管平臺(tái)(圖1)的加工和組裝后，作者評(píng)估了其性能，并將其與先前在微芯片電泳裝置上發(fā)表的報(bào)道進(jìn)行了比較。首先是峰值容量的評(píng)估。使用血管緊張素II(ATII)和甲硫啡肽(ME)作為分離標(biāo)記的淬滅肽標(biāo)準(zhǔn)品，在0 ℃下，以1 % FA、25% ACN (BFS毛細(xì)管)和10% HAc(LPA毛細(xì)管)組成的氘代背景電解液(BGE)計(jì)算峰容量。與BFS毛細(xì)管相比，LPA毛細(xì)管除了峰容量值增加外，其序列覆蓋率也明顯增加。作者比較了0 ℃ CE到0 ℃ LC和微芯片電泳的峰容量值。結(jié)果顯示，CE的上峰容量雖小于微芯片電泳方法，但序列覆蓋率更高。而與LC相比，CE的峰值容量大大提高。

　　氘質(zhì)子在淬滅時(shí)和分析時(shí)中的回交(BE)也是HDX實(shí)驗(yàn)主要考察的因素之一。作者使用緩激肽(BK)、ATII和ME作為肽標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)BE進(jìn)行了評(píng)估。在0 ℃、20 kV的條件下對(duì)BFS毛細(xì)管和LPA毛細(xì)管分別進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明，ATII在BFS和LPA毛細(xì)血管上的BE分別為20 %和34 %。ATII在LPA毛細(xì)管上的BE值與已報(bào)道的商業(yè)和實(shí)驗(yàn)室改裝的UPLC平臺(tái)的數(shù)據(jù)(28~36 %)相似，而在BFS毛細(xì)管上則接近直接進(jìn)樣完全氘代標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到的BE水平。此外，由于注入到毛細(xì)管中的樣品量與LC所使用的樣品量相比很低，在檢測(cè)的質(zhì)譜中沒有出現(xiàn)任何殘留的跡象。

　　作者對(duì)溶液中牛血紅蛋白(Hb)進(jìn)行了HDX，隨后又進(jìn)行了淬滅、胃蛋白酶酶切、低溫毛細(xì)管電泳分離與質(zhì)譜(MS)檢測(cè)。圖2顯示了根據(jù)Kyte-Doolittle疏水性指數(shù)選擇的6個(gè)肽段在不同分離條件下相應(yīng)的電泳圖譜和氘代速率。從圖中可以看出，LPA毛細(xì)管上分離的肽段峰形更對(duì)稱，信號(hào)強(qiáng)度比BFS毛細(xì)管上高一個(gè)數(shù)量級(jí)左右。與BFS毛細(xì)管相比，LPA涂層的毛細(xì)管整體的氘標(biāo)記保留絕對(duì)值較低，但氘代速率沒有檢測(cè)到差異。雖然BFS毛細(xì)管遷移時(shí)間更快，但由于BFS毛細(xì)管在樣品進(jìn)樣之間需要更多的沖洗步驟，因此分析時(shí)間比使用LPA毛細(xì)管要長(zhǎng)。

       圖2.強(qiáng)度歸一化的提取離子電泳圖譜，顯示了BFS和LPA毛細(xì)血管之間遷移時(shí)間的差異，以及標(biāo)記Hb的消化性中的6個(gè)代表性肽的HDX動(dòng)力學(xué)圖。橙色的跡線顯示了使用BFS毛細(xì)管分離的結(jié)果，紫色的跡線顯示了使用LPA涂層毛細(xì)管分離的結(jié)果。肽段序列的注釋及其對(duì)應(yīng)的Kyte-Doolittle疏水性指數(shù)顯示在右方。(左)在500 s標(biāo)記時(shí)間點(diǎn)顯示了代表性的峰形和遷移時(shí)間。(右)BFS毛細(xì)管中的氘代保留更高。誤差棒表示一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n = 3。有些多肽在所有孵育時(shí)間內(nèi)只存在于LPA涂層中，因此上述六個(gè)面板其中的兩個(gè)面板沒有在BFS毛細(xì)管中的痕跡。α 136 - 141在BFS毛細(xì)管上分離的特定樣品在500 s時(shí)間點(diǎn)顯示，但在以后的時(shí)間點(diǎn)沒有足夠的質(zhì)量，從最終的數(shù)據(jù)集中省略，因此HDX動(dòng)力學(xué)圖不包括該肽段。β 35 - 40沒有被檢測(cè)到，也未被包括在HDX動(dòng)力學(xué)圖中。

　　 ，本文研究了HDX CE-MS平臺(tái)在表征結(jié)構(gòu)相關(guān)信息方面的作用。作者比較了非變性條件下的Hb樣品與用6 M尿素置于變性條件下的Hb樣品的相對(duì)氘代值。研究發(fā)現(xiàn)，在非變性狀態(tài)下更容易受到HDX保護(hù)的位點(diǎn)與Hb亞基的相互作用位點(diǎn)相吻合。具體來(lái)說(shuō)，α-Hb上的R32-Y43和L92-D127以及β- Hb上的R29-E42和D98-Q130與這兩個(gè)單體相互結(jié)合的位置相吻合。數(shù)據(jù)顯示(圖3)，與局部區(qū)域的尿素暴露狀態(tài)相比，Hb的非變性狀態(tài)對(duì)HDX的敏感度降低。這一發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證了該方法可作為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的潛在工具——能夠表征分子結(jié)合和構(gòu)象動(dòng)力學(xué)，如蛋白質(zhì)-配體相互作用中遇到的問(wèn)題。

       圖3. Hb的HDX數(shù)據(jù)在PDB 1FSX上的映射。在非變性條件下用D2O標(biāo)記的Hb與用6 M尿素變性后標(biāo)記的Hb進(jìn)行比較。顏色刻度表示50,000 s氘摻入后，天然/尿素D吸收量的比值。

　　總的來(lái)說(shuō)，本研究提供了低溫CE - MS應(yīng)用于溶液內(nèi)標(biāo)記HDX的理論證明。盡管BFS毛細(xì)管提供了快速的肽段分離和標(biāo)記肽段的較小氘損失，但研究結(jié)果表明LPA涂層的毛細(xì)管在HDX CE - MS中更有優(yōu)勢(shì)。有很多途徑能夠?qū)崿F(xiàn)該平臺(tái)的進(jìn)一步優(yōu)化，包括但不限于BGE優(yōu)化(pH、有機(jī)質(zhì)含量、濃度)、濃縮/脫鹽步驟、固定化/嵌入式蛋白酶消化、升級(jí)Peltier元件以實(shí)現(xiàn)更低溫的分離、集成無(wú)鞘電噴霧界面、交替毛細(xì)管涂層和評(píng)估更長(zhǎng)或更短的毛細(xì)管。

　　撰稿：陳鳳平

　　編輯：李惠琳，羅宇翔

　　文章引用：Zero-Degree Celsius Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization for Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

　　參考文獻(xiàn)

　　1. Aerts, J. T.; Andren, P. E.; Jansson, E. T., Zero-Degree Celsius Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization for Hydrogen Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2022.

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